首页  > 专题中心
专题中心

免疫染色4-免疫染色

1.一抗的稀释及孵育

一抗稀释

请务必按照建议的稀释比例使用抗体,以便获得较高的信噪比(S/N)。一方面,如果抗体的使用浓度过低,会导致荧光信号十分模糊,无法与本底噪声区分开来;另一方面,浓度过高会引发本底非特异染色,最终导致S/N较低。一般来讲,抗体说明书中的建议比例是厂家的科学家通过使用阳性和阴性样本进行滴定测试,筛选的技能提供最佳信号又能最大程度降低本底染色的理想浓度(例如CST)。当然如果抗体说明书中没有给出明确浓度,只给了推荐范围,也可以通过滴定法预实验找到最佳的抗体稀释浓度。


*小优博士Tips:一抗选择应尽量避免与被检测样品种属相同(例如鼠対鼠染色),因为二抗可能会与某些内源性的免疫球蛋白结合,导致背景过高。如实在避免不开,可以使用一个未经一抗染色的对照载玻片,以确定二抗是否是背景染色的来源。

 

抗体稀释液选择

一般推荐用封闭缓冲液即可。

 

抗体孵育

抗体孵育时建议用免疫组化笔在样本周围画圈,可防止抗体稀释液扩散,节约抗体。孵育过程我们建议4℃的温度下进行过夜孵育;当然有条件的实验室可以选择自动化平台的简短孵育,可根据情况选择。孵育时应在湿盒中进行,防止样本变干。


*小优博士Tips:实验过程中应避免样本变干,因为样本变干会导致非特异染色升高,背景染色升高,降低信噪比。

 

2.二抗的稀释及孵育

一抗孵育完毕后需对样本切片进行清洗,清洗过后按说明书推荐稀释比例稀释的二抗在室温、湿润环境下(湿盒中)孵育1-2小时(如进行IF实验,二抗带有荧光基团,需在避光条件下进行孵育)。


*小优博士Tips:一抗、二抗及复染之间需要对样本切片充分的清洗,这一步骤对于获得对比鲜明的低背景高信号至关重要。虽然经过验证的抗体其抗原结合区域对靶表位具有较高的亲和力,但其他区域可能存在较低程度的亲和力,也可能存在非特异性相互作用,最终导致样本背景升高。一般来讲,清洗采用TBST、TBS或PBS等缓冲液,室温摇床清洗3-5分钟即可。 

 

3.检测及复染(可选)

IHC的显色方法需要根据二抗标记物类型选择,主要包括HRP、AP、葡萄糖氧化酶等,较为常用的二抗为HRP标记的二抗,而显色底物常用DAB,在这里主要介绍HRP二抗的检测系统及DAB显色方法和复染方法。其他酶及显色底物见下表。


 


DAB底物与HRP反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。颜色随着反应时间延长而加深,所以在显色过程中,需密切监控得到合适的显色强度,这一步骤需在显微镜下配合观察。一般而言,1-10分钟即可获取可接受的显色强度,然后将切片置于蒸馏水(dH2O)中,终止染色反应。


抗体检测结束后,大多数研究者在封固样本前还会倾向于选择复染剂对样本切片进行复染,凸显细胞结构使得染色结果更有利于观察。目前,有多种复染剂可供选择,详情见下表。在实验中需选择与色原颜色差别较大的复染剂,对于DAB色原,我们推荐使用苏木精对样品进行复染,胞核染色呈现蓝色。

 

 
IF实验由于二抗带有荧光基团,不需进行额外的染色步骤,在实验过程中注意避光,以及二抗的荧光基团类型,选择对应的显微镜参数即可进行检测。
作为研究亚细胞定位变化的理想方法,大部分IF实验也需要进行复染,来标记已知的细胞器标志物、其它目标蛋白或其它细胞结构来帮助我们分析目的蛋白定位。常用的复染剂包括鬼笔环肽(标记肌动蛋白微丝)、DAPI(标记DNA/细胞核)、CMXRos(标记线粒体)等。需要注意的是使用复染试剂,要谨慎的分析荧光基团发光谱与二抗荧光基团是否有冲突,避免出现串色等现象。

 

免疫染色相关产品推荐

产品货号

产品名称

产品规格

用途

abs929

PAP Pen 组化笔

1支

免疫染色

8059P

SignalStain® DAB Substrate Kit

1盒

免疫染色

TL-015-QHD

二抗试剂盒

15ml

免疫染色

8112S

SignalStain® Antibody Diluent

25/100 ml

免疫染色


上海优宁维生物科技股份有限公司

试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链

免费热线:4008-168-068

咨询邮箱:info@univ-bio.com

订购商城:www.univ-bio.com

微信公众平台:优宁维抗体专家,欢迎关注!

小优博士(小程序):5大课堂, 让你的科研不再难!

公众号
小程序