问题/现 |
可能的原因 |
改善方法 |
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封闭不充分 |
延长封闭时间,提高封闭剂浓度或考虑更换封闭剂 |
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抗体浓度过高 |
稀释抗体浓度,以更高稀释度抗体孵育更长时间 |
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二抗与封闭剂非特异性结合 |
设置二抗对照(不加一抗) |
背景高 |
一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 |
在孵育和清洗中加入温和去污剂(吐温-20);脱脂奶粉中含有磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而产生高背景,用BSA作封闭剂 |
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清洗不充分 |
增加清洗次数和时间 |
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膜干燥 |
全程膜要保持在充分的反应液中 |
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胶片曝光过度 |
缩短曝光时间和化学发光底物反应时间 |
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蛋白与膜的非特异性结合 |
确保使用干净的转印设备和高质量的试剂等 |
问题/现象 |
可能的原因 |
改善方法 |
背景有不均匀白斑 |
转膜时膜上有气泡 |
转膜操作时注意不要留有气泡 |
抗体孵育时与膜接触不充分 |
抗体孵育时保持 |
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背景有黑斑 |
抗体结合了封闭剂 |
过滤封闭剂 |
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