首页  > 专题中心
专题中心

基因魔剪—CRISPR/Cas9系统(一)

 

这一次小优专题给您带来的是什么内容呢?没错,就是当下最火的基因编辑技术—被称为基因魔剪的CRISPR/Cas9基因编辑系统。优宁维生物技术股份有限公司现在提供目标特异性的CRISPR/Cas9敲除质粒,CRISPR/Cas9产品涵盖编码18910种人类蛋白质以及18340种小鼠蛋白质的基因,同时,为您提供实验中需要用到的转染试剂、细胞培养基以及抗体等产品。

 
 

那么,什么是CRISPR/Cas9系统呢?小优先带您了解一下。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA1,2。在细菌与古细菌体内,CRISPR基因座捕获并融合噬菌体等带来的外来遗传物质形成的新的区域也被叫做间隔序列,其形成了一段序列特异性的片段用来抵抗噬菌体未来的侵染。这些序列特异性的片段,被转录成相应的短CRISPR RNA(crRNAs),发挥向导作用,指引同样由CRISPR基因座编码表达的CRISPR关联蛋白(Cas)直接剪切掉外源入侵的DNA1,2。CRISPR II型系统的Cas9核酸酶有一个RNA结合结构域,一个α螺旋识别区(REC),一个包含RuvC和HNH来进行DNA剪切的核酸酶功能区,以及一个原型间隔序列毗邻基序(PAM)作用位点1,2。crRNA通过结合到REG区域中的α螺旋桥上与Cas9核酸酶形成复合体,并且与crRNA的主体形成多重盐桥1,2,3。

 
 

当crRNA结合到Cas9上时,Cas9构像发生改变,允许DNA结合1,2,3。Cas9/crRNA复合体通过PAM(5’-NGG)位点扫描DNA序列4,5,6。PAM位点识别成功以后,引起对应位置的DNA解旋,允许crRNA通过碱基互补配对的方式检测临近PAM位点的DNA序列。当临近PAM位点的序列与crRNA可以互补配对时,REC区域中的螺旋桥会与目标DNA形成一个RNA-DNA的杂合双链3,4,7,进而激活HNH与RuvC核酸酶结构域活化,使目标DNA双链断裂(DSB),引起DNA降解1,2,5,8。如果crRNA不能与临近PAM位点的DNA序列互补配对,Cas9复合体则与DNA脱离,继续扫描下一个PAM位点7。目标基因的DNA双链断裂,可以通过非同源末端结合(NHEJ)方式修复,通过这种方式可以插入或敲除错误序列,或者通过同源重组修复(HDR)方式修复,可以被用来在基因组的特定位点与选定的标记结合2,9,10。CRISPR/Cas9机制可以在多种系统中进行基因编辑,包括在哺乳动物细胞中。

 
 
 
图1. CRISPR/Cas系统作用原理示意图
 
 

通过造成DNA双链断裂来进行基因编辑的方式还包括大范围核酸酶技术,锌指核酸酶(ZFNs)技术以及转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术,后两种技术也可以识别特异性的DNA序列,但是,这些技术都有他们的局限性。大范围核酸酶技术的缺点在于很难确认核酸酶是否作用与DNA序列的特异性识别位点。而ZFNs和TALENs技术则很难设计以及无法识别3个碱基以上的DNA序列。发挥类似于crRNA作用的小向导RNA(sgRNAs)设计简单,并且可以与Cas9核酸酶共同使用一个载体表达,进而特异性的识别DNA位点进行基因编辑。CRISPR/Cas9系统在筛选中的应用相较于小发卡RNAs也有灵敏度更高和效率更高的优势。

 
 
 
 

Dharmacon Edit-R CRISPR-Cas9 系统通过提供可直接转染的预制DNA和RNA组分或预制高滴度慢病毒颗粒,避免费时费力的sgRNA表达载体构建或病毒包装过程,极大地简化了基因编辑的工作流程。转入细胞的crRNA和tracrRNA直接参与基因打靶,避免了不易控制产物剂量且活性受启动子和细胞环境影响极大的转录过程,使得研究者可以对同一或不同基因的多个靶点迅速完成评估;高滴度病毒颗粒文库可直接进行全基因组或基因家族/信号通路混合筛选,满足不同实验需求。

 
图2. CRISPR/Cas9基因编辑流程

除了基因编辑,CRISPR系统还被改造利用在增强内源性基因表达方面。许多CRISPR系统的组件已经被改造成适应协同激活介导因子(SAM)的复合体,成为高效率的特异性转录因子激活系统。其中,一个SAM复合体中的组件是由Cas9核酸酶改造而来。在SAM系统中,Cas9的催化亚区已经被失活,并且将失去核酸酶活性的dCas9与一个转录激活亚区(VP64)融合。这样,由特异性的向导RNA(sgRNA)引导,dCas9-VP64-sgRNA复合体结合到目的基因转录起始位点(TSS)上游200 bp左右的区域,就会使目的基因的转录水平上调。为了进一步增强转录,sgRNA经过改造,在四环以及主环上加上了小的发卡样核酸适配体。这个加到sgRNA上面的核酸适配体会选择性的结合到带有MS2二聚体的噬菌体外壳蛋白上13。将MS2蛋白与p65和HSF1反式转录激活结构域融合,使得MS2-P65-HSF1融合蛋白可以增强对转录因子的募集作用,这样就会增强dCas9调节的基因激活能力。怎么样,经过小优的讲解,大家是不是对CRISPR/Cas9系统更加了解了呢?在接下来的小优专题CRISPR/Cas9篇中,小优将为您带来CRISPR/Cas9实验流程中优宁维可以为您提供的解决方案和优质的产品与服务,敬请期待。

 
 
References
1.Van der Oost J., et al. 2014. Unraveling the Structural and Mechanistic Basis of CRISPR-Cas Systems. Nat. Rev. Microbiol. (7):479-92. PMID 24909109.
2.Hsu, P., et al. 2014. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Editing. Cell. 157(6):1262-78. PMID 24906146.
3.Nishimasu, H., et al. 2014. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 156(5):935-49. PMID 24529477.
4.Deltcheva, E., et al. 2011. CRISPR RNA Maturation by Trans-Encoded Small RNA and Host Factor RNASE III. Nature. 471: 602-607. PMID 21455174.
5.Jinek, M., et al. 2012. A Programmable Dual-RNA Guided DNA Endonuclease in Adaptive Immunity. Science. 337(6096):816-21. PMID 22745249.
6.Deveau, H., et al. 2010. CRISPR/Cas System and its Role in Phage-Bacteria Interaction. Annu. Rev. Microbiol. 64: 475-493. PMID 20528693.
7.Sternberger, SH., et al. 2014. DNA Interrogation by the CRISPR RNA-guided Endonuclease Cas9. Nature. 507(7490):62-7. PMID 24476820.
8.Gasuinas, G., et al. 2012. Cas9-crRNA Ribonucleoprotein Complex Mediates Specific DNA Cleavage for Adaptive Immunity in Bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. 109(39):E2579-86. PMID 22949671.
9.Mali, P., et al. 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121): 823-6. PMID 23287722.
10.Ran, FA., et al. 2013. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. (11): 2281-308. doi: 10.1038/nprot.2013.143. PMID 24157548.
11.Shalem O., et al. 2014. Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. 343(6166):84-7. PMID 24336571.
12.Ran, F.A., et al. 2013. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 154: 1380-1389.
13.Konermann, S., et al. 2015. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517: 583-588. PMID 25494202
 

上海优宁维生物科技股份有限公司

抗体专家 | 流式专家 | 免疫组化专家 | 实验服务专家 | 科学仪器

 

免费热线:4008-168-068 

咨询邮箱:info@univ-bio.com      

网站:www.univ-bio.com

 

微信公众平台:优宁维抗体专家,欢迎关注!

优宁维抗体专家.gif

 

上海优宁维生物科技股份有限公司

试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链

免费热线:4008-168-068

咨询邮箱:info@univ-bio.com

订购商城:www.univ-bio.com

微信公众平台:优宁维抗体专家,欢迎关注!

小优博士(小程序):5大课堂, 让你的科研不再难!

公众号
小程序